革蘭氏染色液技術(shù)
文章出處:本站 人氣:6073 發(fā)表時(shí)間:2019-03-23 12:58:32
作者經(jīng)過(guò)對(duì)比試驗(yàn),研究了菌齡、涂片厚度、媒染時(shí)間、脫色時(shí)間的變化對(duì)革蘭氏染色液結(jié)果的影響。結(jié)果表明:革蘭氏染色時(shí),大腸桿菌培養(yǎng)24h左右為宜,而枯草芽孢桿菌培養(yǎng)15h左右為宜;涂片厚度應(yīng)均勻薄片;媒染時(shí)間控制在60s;脫色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在25~30s。
關(guān)鍵詞: 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 革蘭氏染色 影響因素
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的種重要的鑒別方法,而實(shí)驗(yàn)成功率低,常常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果,對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)難度較大。因此,我們選取大腸桿菌作為G代表,枯草芽孢桿菌作為G代表,分析影響革蘭氏染色結(jié)果的各種因素,提高染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。
1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1菌種:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。
1.2試劑:草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、番紅染液。
2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果
2.1菌齡對(duì)染色結(jié)果的影響
革蘭氏染色要求菌種被染色時(shí)處于活躍生長(zhǎng)期。大腸桿菌的活躍生長(zhǎng)期為24h左右,枯草芽孢桿菌活躍生長(zhǎng)期為在14~16h,故對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的菌種分別選擇10個(gè)時(shí)間段進(jìn)行革蘭氏染色觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
由表1可見(jiàn),培養(yǎng)時(shí)間對(duì)染色結(jié)果影響較大,不同菌種對(duì)培養(yǎng)時(shí)間有不同要求。處于活躍生長(zhǎng)期的菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)為典型,能正確反映染色的結(jié)果。其中,大腸桿菌培養(yǎng)24h左右為宜,而枯草芽孢桿菌培養(yǎng)15h左右為宜。
2.2涂片厚度對(duì)染色結(jié)果的影響
用直徑3mm的接種環(huán)分別挑起培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌滿環(huán)、半環(huán)、更少量涂片,從中央向外圍涂開(kāi),使細(xì)菌在小滴生理鹽水中涂成直徑約1cm的菌膜,堆積密度由濃厚到均勻分散,作革蘭氏染色觀察。結(jié)果顯示:涂片濃厚時(shí),大腸桿菌因密集脫色不完全而呈陽(yáng)性反應(yīng),枯草芽孢雖呈陽(yáng)性但是染色均勻度欠佳;涂片太薄,菌體過(guò)于稀少,觀察時(shí)尋找視野較麻煩。因此,只有在菌膜厚度均勻分散、肉眼能見(jiàn)無(wú)菌生理鹽水稍顯渾濁時(shí),才能得到較佳的染色結(jié)果。
2.3媒染時(shí)間對(duì)染色結(jié)果的影響
將培養(yǎng)24h左右的大腸桿菌和培養(yǎng)15h左右的枯草芽孢桿菌革蘭氏染色,碘液作為媒染劑,覆蓋時(shí)間分別為30s、60s、90s、120s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
由表2可見(jiàn),媒染時(shí)間過(guò)短,不利于結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物與細(xì)胞之間的結(jié)合,可能造成枯草芽孢桿菌(G)呈假陰性的結(jié)果,但對(duì)大腸桿菌(G)無(wú)影響;反之,媒染時(shí)間過(guò)長(zhǎng),結(jié)合過(guò)于牢固,容易造成大腸桿菌(G)假陽(yáng)性的結(jié)果,但對(duì)枯草芽孢桿菌(G)影響非常小。因此,媒染時(shí)間應(yīng)控制在60s為宜。
2.4乙醇脫色對(duì)染色結(jié)果的影響
脫色是影響革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟,脫色時(shí)間直接關(guān)系到染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們選擇10s至60s的脫色范圍,分6個(gè)時(shí)間分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
由表3可見(jiàn),脫色程度不夠,大腸桿菌(G)可被染成假陽(yáng)性,對(duì)枯草芽孢桿菌(G)影響較??;脫色過(guò)度,枯草芽孢桿菌(G)容易成假陰性,對(duì)大腸桿菌(G)影響較小。這是由于酒精脫色時(shí)間長(zhǎng)使得細(xì)胞壁中脂類(lèi)物質(zhì)易被溶解,細(xì)胞通透性增大,導(dǎo)致結(jié)晶紫—碘復(fù)合物易被抽提出來(lái);反之,脫色時(shí)間短,復(fù)合物就不易從細(xì)胞壁中逸出,而兩種菌種化學(xué)組成有差別,染色受影響程度不樣。因此,革蘭氏染色時(shí),定要嚴(yán)格控制酒精脫色時(shí)間,般以25~30s為宜。
3.結(jié)果分析
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)和分析,我們認(rèn)為菌齡、細(xì)菌密集程度、媒染時(shí)間、酒精脫色程度這幾個(gè)因素都會(huì)影響革蘭氏染色液結(jié)果的正確性,同時(shí)還受干燥、固定等操作的影響。因此在進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研工作中,除操作正確適當(dāng)外,更重要的是選擇適合的菌齡和準(zhǔn)確把握脫色時(shí)間,這樣才能保證染色結(jié)果的正確性。
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