革蘭氏染色液為什么會有不同的顏色?
假如人們把病菌當做是個雞蛋得話,那麼細胞壁就好像像蛋殼。它包囊在體細胞表層,是里側(cè)緊靠細胞質(zhì)的1個比較堅毅、略具延展性的構(gòu)造,具備固定不動病菌外觀設(shè)計和維護病菌體細胞等幾種作用。
因為病菌體細胞小而全透明,務必對它開展染色劑,使染色劑后的菌體與背景圖產(chǎn)生顯著的偏色,進而在般光學顯微鏡下更清晰地觀查其形狀。1884年名美國大夫C.Gram根據(jù)初染、媒染、褪色和復染三步實際操作,將全部病菌區(qū)別為兩類:染色劑反映后呈紫藍色的稱之為革蘭陽型病菌,用G+表達;染色劑反映后呈鮮紅色的稱之為革蘭呈陰性病菌,用G-表達。大部分病毒性革蘭陰性桿菌都歸屬于革蘭陽性菌,而大部分腸胃菌多歸屬于革蘭陰性菌。病菌對革蘭染色的不樣反映,我覺得就是說因為細胞壁的成份和構(gòu)造不樣而導致的。
不論是革蘭陽性菌還是革蘭陰性菌,細胞壁的關(guān)鍵構(gòu)成是由這種被稱作肽聚糖的化學物質(zhì)組成。這種化學物質(zhì)能夠織成1個反射性較強的多孔結(jié)構(gòu),即宛如建筑鋼筋骨架圖網(wǎng)組成的片層;終再根據(jù)這種被稱作磷壁酸的化學物質(zhì)將多孔結(jié)構(gòu)的片層開展互相門鉸鏈,終產(chǎn)生了條很厚病菌“城門”——細胞壁。雖然體細胞內(nèi)高血漿滲透壓,體細胞外低滲的氧分子持續(xù)進到體細胞內(nèi),但細胞壁可以把體細胞牢牢地地箍住,避免體細胞溶脹裂開。而人們平常根據(jù)食鹽水侵泡方式 來清洗新鮮水果,或者在高濃的椰子水中侵泡的食材不容易環(huán)境污染病菌,其基本概念就是說外界導致的高血漿滲透壓自然環(huán)境,導致體細胞內(nèi)氧分子向外外滲,造成病菌造成質(zhì)壁瓦解而身亡。
所不樣的是,革蘭陽性菌的細胞壁簡易,厚而高密度,高達20層。肽聚糖占90%,其他的10%為磷壁酸。革蘭陰性菌的細胞壁薄而繁雜,肽聚糖層僅1到2層,稀少而沖擊韌性差,肽聚糖層外也有脂多糖、不飽和脂肪酸和脂蛋白等化學物質(zhì)構(gòu)成的外膜,有時候也稱之為表面。
普遍革蘭陽型病菌:有芽胞的鏈球菌,大部分的革蘭陰性桿菌,全部放線菌和細菌;普遍革蘭呈陰性病菌:弧菌,螺旋體和大部分高致病的無芽孢桿菌
革蘭氏染色步驟
1、介紹:
革蘭氏染色法歸屬于復染法,是細菌學中普遍的這種鑒別染色法。沒經(jīng)染色劑的病菌,因為其與周邊環(huán)境折射率區(qū)別不大,故在光學顯微鏡下不易觀查,染色劑后,病菌與自然環(huán)境產(chǎn)生特的比照,能夠清晰地觀查到病菌的形狀、排序及些特點,用于歸類辨別。
2、試驗流程:
革蘭氏染色法通常包含初染、媒染、褪色、復染等4個流程,具體步驟方式 是:
1)取載玻片用沙布擦水,載玻片的邊用marker字的筆畫1個小圈(用于大概明確菌液體的部位)。涂菌的位置在火苗上烤下下,去除植物油脂。
2)抗酸染色:
液體培養(yǎng)液:右手持菌液試管嬰兒,在酒精噴燈火苗周邊5cm上下開啟管蓋;左手持接種環(huán)在火苗中灼燒殺菌,等水冷卻后從試管嬰兒中沾取菌液個環(huán)節(jié),在清潔無脂的載玻片上涂直徑2mm上下的聚氨酯涂料,終將接種環(huán)在火苗上灼燒殺菌(通常狀況下應用固態(tài)培養(yǎng)液)。
固態(tài)培養(yǎng)液:先往載玻片上滴幾滴無菌檢測水,再用接種環(huán)取小量菌體,涂在載玻片上,使其薄而勻稱。
3)晾曬:讓抗酸染色在氣體中大自然干躁。
4)固定不動:讓菌膜朝上,根據(jù)火苗2-3次固定不動(以不發(fā)燙為宜)。
5)染色劑:滴加1至2滴革蘭結(jié)晶紫液(Gram Crystal Violet)遮蓋菌膜,染1min,自來水遲緩清洗抗酸染色上的染色液,用吸水紙吸走。
6)媒染:滴加1至2滴革蘭碘液(Gram Iodine)遮蓋菌膜,染1min,自來水遲緩清洗抗酸染色上的染色液,用吸水紙吸走。
7)褪色:持續(xù)滴加95%酒精(Gram Decolorizer 革蘭脫色劑)褪色20-30s至排出液無藍紫色,馬上自來水遲緩清洗抗酸染色上的染色液,用吸水紙吸走。
8)復染:滴加1至2滴革蘭蕃紅(Gram Safranin)復染1-2min,手洗,汲取殘余水。到此,革蘭氏染色完畢。
9)觀查:用光學顯微鏡變大陪數(shù)觀查色調(diào)。
3、基本原理:
1)根據(jù)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后,在細胞壁內(nèi)產(chǎn)生了不溶解水的結(jié)晶紫與碘的復合物;
2)革蘭氏陽性菌因為其細胞壁過厚、肽聚糖網(wǎng)層級較多且化學交聯(lián)高密度,故遇酒精或甲苯褪色解決時,因缺水反倒使孔環(huán)變小,加上它沒有類脂,故酒精解決不容易出現(xiàn)間隙,因而可以結(jié)晶紫與碘復合物緊緊留到壁內(nèi),使其仍呈藍紫色;
簡易了解:革蘭氏陰性菌的細胞壁類脂含水量低,酒精在褪色時反倒使細胞壁脫干進而肽聚層直徑變小,減少了細胞壁的滲透性,進而使病菌保存了初染的色調(diào),紫藍色;
3)革蘭氏陰性菌以其細胞壁薄、外膜層類脂含水量高、肽聚糖層薄且化學交聯(lián)度差,在遇脫色劑后,以類脂主導的外膜快速融解,薄而疏松的肽聚糖網(wǎng)不可以阻攔結(jié)晶紫與碘復合物的溶出,因而根據(jù)酒精褪色后仍呈沒有顏色,再經(jīng)沙黃等鮮紅色染劑復染,就使革蘭氏陰性菌呈鮮紅色;
簡易了解:革蘭氏陰性菌的細胞壁類脂含水量高,酒精在褪色時融解了類脂質(zhì),提升了細胞壁的滲透性,進而復合物外滲,再復染時再呈鮮紅色;
4、結(jié)果:
染色劑的差別關(guān)鍵是因為呈陰性與陽型病菌細胞壁的差別所造成的。革蘭氏陽性菌呈紫藍色,革蘭氏陰性菌呈鮮紅色。
5、將會偏差:
在試驗中常常會出現(xiàn)假陽性和假呈陰性的結(jié)果,假陽性關(guān)鍵是因為褪色不徹底,將會是因為抗酸染色過厚,或是是結(jié)晶紫染色劑過多,造成褪色不徹底。假呈陰性將會由于體細胞固定不動過多,導致細胞壁滲透性的更改,而出現(xiàn)假呈陰性結(jié)果;另個,細胞培養(yǎng)時間過長,將會早已有部分體細胞產(chǎn)生身亡或是自溶,也造成細胞壁滲透性的更改而出現(xiàn)假呈陰性結(jié)果。