革蘭氏染色和抗酸染色
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的種鑒別染色法,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。未經(jīng)染色之細(xì)菌,由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小,故在顯微鏡下難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比,可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征,而用以分類鑒定。革蘭氏染色屬復(fù)染法。
步驟
革蘭氏染色法般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟,
具體操作方法是:
1)涂片固定。
2)草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。
3)自來水沖洗。
4)加碘液覆蓋涂面染約1分鐘。
5)水洗,用吸水紙吸去水分。
6)加95%酒精數(shù)滴,并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色,20秒后水洗,吸去水分。
7)蕃紅染色液(稀)染1分鐘后,自來水沖洗。干燥,鏡檢。
原理
通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后,在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物,革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密,故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí),因失水反而使網(wǎng)孔縮小,再加上它不含類脂,故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙,
因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi),使其仍呈紫色;而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差,在遇脫色劑后,以類脂為主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出,因此通過乙醇脫色后仍呈無色,再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染,就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
染色的差異主要是由于陰性與陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的。
1.革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚(20-80nm)而致密的肽聚糖層,多達(dá)50層,占細(xì)胞壁成分的40%~95%,它同細(xì)胞膜的外層緊密相連。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid),也稱胞壁質(zhì)(murein),它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷,它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽離子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān),細(xì)胞生長(zhǎng)中有自溶素(autolysins)酶類起作用,磷壁酸對(duì)自溶素有調(diào)節(jié)功能,阻止胞壁過度降解和壁溶。 如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶,G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體(protoplasts),細(xì)胞壁不復(fù)存在,而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外,大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含少蛋白質(zhì)。
2.革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁 G—細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁薄(15~20nm)而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,分外膜(outer membrane)和肽聚糖層(2~3nm)。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有個(gè)明顯的空間,稱為壁膜間隙(periplasmic space)。 外膜 G—細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類脂,但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。 LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的碳水化合物分子組成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脫氧已糖。由于糖的種類不同,使各種G—細(xì)胞具有不同特性的LPS。核心多糖(corepolysaccharide)的主要組分是酮脫氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。外膜中還含有幾種蛋白,如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin),調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞;有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體;許多G—細(xì)菌對(duì)高等生物有致病性是由LPS的成分決定的,它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素(endotoxins)。 肽聚糖層 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄,在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單層。
肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過脂蛋白連接起來。 壁膜間隙 G—細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙,層薄的肽聚糖處于其間,肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬,肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12~15nm,呈膠胨態(tài)。其間含有三類蛋白質(zhì):水解酶,催化食物的初步降解;結(jié)合蛋白,啟動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程;化學(xué)受體(chemoreceptors),在趨化性中起作用的蛋白。
染色結(jié)果
革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。
抗酸染色法acid-fast staining method 1882年由埃利希(F.Ehrlich)創(chuàng)并經(jīng)F.齊爾(Ziehl)改進(jìn)而創(chuàng)造出的細(xì)菌染色法。
抗酸染色的原理
分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì),包圍在肽聚糖的外面,所以分枝桿菌般不易著色,要經(jīng)過加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后,就很難被酸性脫色劑脫色,故名抗酸染色。
齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物,用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后,分枝桿菌仍然為紅色,而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。
抗酸染色般步驟
1)初染 用玻片夾夾持涂片標(biāo)本,滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴,在火焰高處徐徐加熱,切勿沸騰,出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開,若染液蒸發(fā)減少,應(yīng)再加染液,以免干涸,加熱3-5分鐘,待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。
2)脫色 3%鹽酸酒精脫色30秒~1分鐘;用水沖洗。
3)復(fù)染 用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘,水洗,用吸水紙吸干后用油鏡觀察。
抗酸染色的染液配制
1、石炭酸復(fù)紅 堿性復(fù)紅酒精飽和溶液 10mL 5%石炭酸 90mL
2、3%鹽酸酒精 濃鹽酸 3mL 95%酒精97mL
3、呂氏美蘭液 美蘭酒精飽和液 30mL 氫氧化鉀(1:10000)100mL