革蘭氏染色的基本原理和影響其結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素分析
革蘭氏陽性菌染色是項經(jīng)典的病菌鑒別手段，自十九世紀(jì)八十年代荷蘭的醫(yī)生GRAM開創(chuàng)起，迄今早已近個半個世紀(jì)，依然在病菌的檢驗和評定歸類上被廣泛運用著。在中國，GB4789系列產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)中許多 病原菌的檢驗也都必須開展革蘭氏陽性菌染色，由此可見其必要性。乃至可以說沒有精確把握革蘭氏陽性菌染色的微生物菌種檢查員，不容易是個達(dá)標(biāo)的檢查員。
革蘭氏陽性菌染色基本原理
病菌先經(jīng)過堿性染料結(jié)晶紫染色，然后經(jīng)碘液開展媒染，以后用酒精脫色，在定標(biāo)準(zhǔn)底下的病菌媒染后的色調(diào)不被脫下，有的可被脫下，因而可把病菌分成兩類，前面種稱為革蘭氏陽性菌(G+),后面種為革蘭氏陽性菌陰性菌(G-)。為便捷進(jìn)步觀查，脫色后可再用種鮮紅色染劑如偏堿番紅等開展復(fù)染。陽性菌仍帶藍(lán)紫色，陰性菌則被再次沾染鮮紅色。有芽胞的鏈球菌和大部分的革蘭陰性桿菌，及其全部的放線菌和細(xì)菌都呈革蘭氏陽性菌正反映；弧菌、球菌和大部分高致病的無枯草芽孢菌都展現(xiàn)負(fù)反映。
細(xì)菌細(xì)胞根據(jù)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了不溶解水的結(jié)晶紫與碘的氧化氮合酶，革蘭氏陽性菌因為其植物細(xì)胞偏厚、肽聚糖網(wǎng)層級較多且化學(xué)交聯(lián)高密度，故遇酒精或甲苯脫色解決時，因缺水反倒使網(wǎng)眼變小，再再加它沒有脂質(zhì)，故酒精解決不容易出現(xiàn)間隙，因而可以把結(jié)晶紫與碘氧化氮合酶緊緊留到壁內(nèi)，使其仍呈藍(lán)紫色；而革蘭氏陽性菌陰性菌因其植物細(xì)胞薄、外膜層脂質(zhì)成分高、肽聚糖層薄且化學(xué)交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以脂質(zhì)主導(dǎo)的外膜快速融解，薄而疏松的肽聚糖網(wǎng)不可以阻攔結(jié)晶紫與碘氧化氮合酶的總混，因而根據(jù)酒精脫色后仍呈沒有顏色，再經(jīng)過沙黃等鮮紅色染劑復(fù)染，就使革蘭氏陽性菌陰性菌呈鮮紅色。
革蘭氏陽性菌染色法般流程
1.抗酸染色固定不動。在整潔的蓋玻片中間滴加滴純凈水，用接種環(huán)開展無菌操作原則，挑取塑造物少量，置蓋玻片的水珠中，與水混和制成菌懸液并施膠成直徑厘米的層析。為防止因菌數(shù)過多集聚結(jié)團(tuán)，不利觀查病菌個人形狀，可在蓋玻片側(cè)開展所述實際操作，而在另側(cè)再加滴水，從已施膠的菌液中再取環(huán)在此水珠中開展稀釋液，施膠成層析。若原材料為液體塑造物或固態(tài)塑造物中洗掉制取的菌液，則立即施膠于蓋玻片上就可以，如菌液濃度值很大，也可應(yīng)用水珠再開展次稀釋液。
抗酸染色好是在室內(nèi)溫度標(biāo)準(zhǔn)下使其當(dāng)然干躁，有時候以便使之干得更快些，可將標(biāo)本采集朝向上，手執(zhí)蓋玻片端的兩邊，小心地在酒精燈火苗上邊較高的部位略微加溫，使水份揮發(fā)，但切忌緊貼火苗或加溫時間太長，防止標(biāo)本采集烤枯而形變。
標(biāo)本采集干躁后即開展固定不動，固定不動的目地有三個：(1)殺掉微生物菌種，固定不動細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。(2)確保菌體能更堅固的黏附在蓋玻片上，避免標(biāo)本采集水清洗時被水清洗掉。(3)更改染劑對體細(xì)胞的滲透性，由于死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)便于染色。
固定不動經(jīng)常運用高溫，手持蓋玻片的端(涂有標(biāo)本采集的遠(yuǎn)側(cè)),標(biāo)本采集往上，在酒精燈火苗表層盡早的往返根據(jù)3-4次，共約3s-三秒,并時常以蓋玻片反面加溫，蓋玻片反面觸肌膚，以不知不覺中過燙為宜(不超過60℃),待置放冷后，再開展染色。
2.染色。在固定不動過的抗酸染色菌膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色液應(yīng)徹底遮蓋全部菌膜，染色1min。
3.水清洗。染色到定的時間，拿住裝片使之成450角，用細(xì)微的流水把不必要的染劑清洗掉，被菌體吸咐的染劑則保存。
4.媒染。加碘液遮蓋涂面染1min。在媒染解決時，媒染劑與染劑產(chǎn)生不可溶的化學(xué)物質(zhì)，可提升染劑和病菌的感染力。
5.水清洗。用細(xì)微的流水遲緩清洗抗酸染色上的染色液，用吸水海綿吸走。
6.脫色。加95%酒精數(shù)滴，并輕輕地?fù)u晃開展脫色，20s-30s后再開展水清洗，吸去水份。
7.復(fù)染。蕃紅染色液染色10s后，飲用水清洗。
8.干躁。染色的結(jié)果，革蘭氏陽性菌正反映菌體都呈藍(lán)紫色，負(fù)反映菌體都呈鮮紅色。
危害染色結(jié)果精確性的要條件：
1.實驗試劑危害。它是大家先應(yīng)當(dāng)保證 的，大家應(yīng)用的實驗試劑務(wù)必是合理的。試驗室理應(yīng)創(chuàng)建合理的實驗試劑管理流程，從實驗試劑的工程驗收到儲放、應(yīng)用、到期后的廢料解決都需有嚴(yán)苛要求，保證 大家應(yīng)用的實驗試劑是合理的。磨刀不誤砍柴工工欲善其事，這也是大家實驗取得成功基本的環(huán)。
2.染色菌的挑選。菌齡對革蘭氏陽性菌染色結(jié)果的危害是十分大的。大家染色全過程中挑選的菌應(yīng)該是處在活躍性成長期，那樣的病菌特異性強(qiáng)，生理學(xué)特點顯著，因此 染色的結(jié)果精確度高，般狀況下不容易出現(xiàn)偏差。塑造時間較長的革蘭氏陽性菌，因為體細(xì)胞脆化，乃至有部分菌在染色以前就早已身亡或是自主融解了，導(dǎo)致植物細(xì)胞滲透性提升，便會展現(xiàn)出假陰性。以橙黃色鏈球菌為例子，金葡是典型性的革蘭氏陽性菌，有些人以前統(tǒng)計分析過塑造至不樣時間的金葡的革蘭氏陽性菌染色結(jié)果，結(jié)果顯示，在金葡活躍期的22h-26h中間，染色結(jié)果的準(zhǔn)確度基礎(chǔ)能夠做到100%，而超出26h以后，準(zhǔn)確度就剛開始降低，塑造至36h時，準(zhǔn)確度大約會降低30%上下。因此 我們在染色時，定要挑選處在活躍期、特異性強(qiáng)的菌體，在檢驗全過程中定要嚴(yán)苛的在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的時間范圍內(nèi)開展染色實驗，不可以提早或是推遲。
3.涂菌的情況。在染色開始的施膠中，在挑取菌體后應(yīng)當(dāng)在無菌水上漆成薄薄菌膜。而在施膠全過程中，若是菌體沉積，也會巨大危害染色結(jié)果的精確性。菌體沉積過多，通常菌體中間越來越?jīng)]什么間隙，而其植物細(xì)胞的成份危害導(dǎo)致了脫色的狀況不佳，非常容易造成陽性的結(jié)果。另外，在初染、媒染及復(fù)染的全過程中，應(yīng)將染色液遮蓋全部菌膜，防止部分菌染色而另部分菌沒有染色。因而在抗酸染色全過程定要將菌膜涂得少而勻稱，那樣才可以達(dá)到好實際效果。
4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陽性菌陰性菌的染色結(jié)果有非常大危害。因為媒染時間太長，結(jié)晶紫在碘液長期功效下太過堅固融合在菌體植物細(xì)胞上，危害了酒精的脫色實際效果，進(jìn)而會造成 這類陽性的實際效果。以典型性的革蘭氏陽性菌陰性菌腸子埃希氏菌為例子，有些人做了統(tǒng)計分析，媒染時間嚴(yán)控在40s-60s以內(nèi)，染色結(jié)果準(zhǔn)確度基礎(chǔ)可做到100%，而超出60s準(zhǔn)確度會出現(xiàn)定的減少，若媒染超出100s，準(zhǔn)確度乃至可減少貼近20%上下。因而在媒染全過程中定要留意媒染時間，操縱在50-60s為宜。
5.酒精脫色。酒精脫色也是個對結(jié)果危害很大的操作流程。革蘭氏陽性菌陰性菌和革蘭氏陽性菌關(guān)鍵的差別是植物細(xì)胞肽聚糖層薄厚和構(gòu)造，革蘭氏陽性菌陰性菌植物細(xì)胞肽聚糖層太薄，脂多糖成分高因而在酒精脫色時，細(xì)菌細(xì)胞壁的含糖量成份會被酒精融解，擴(kuò)大了植物細(xì)胞的滲透性，結(jié)晶紫及碘氧化氮合酶就迅速被酒精過柱，以后便會被沙黃復(fù)染呈鮮紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只有具有脫干實際效果而沒法進(jìn)到，那樣結(jié)晶紫和氧化氮合酶就沒法過柱出去使體細(xì)胞呈藍(lán)紫色。因而，酒精脫色時間較短，脫色實際效果不佳，會造成 陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和氧化氮合酶不可以合理的所有過柱出去，便會出現(xiàn)顯著的偏差，使陰性菌出現(xiàn)陽性。而過柱時間太長，也會造成 陽性菌的植物細(xì)胞被酒精毀壞，造成 體細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色被過柱，展現(xiàn)假陰性。因而過柱時間也是革蘭氏陽性菌染色的重要環(huán)節(jié)。過柱時間理應(yīng)嚴(yán)控在20s-30s中間，另外確保過柱實際效果。
小結(jié)下，在全部革蘭氏陽性菌染色全過程中，在確保實驗試劑合理的前提條件下，必須嚴(yán)控的好多個層面：染色菌務(wù)必是在其活躍期內(nèi)，施膠情況不能太厚，媒染時間嚴(yán)控在50s-60s中間，脫色時間嚴(yán)控在20s-30s。掌握之上的重要基準(zhǔn)點，革蘭氏陽性菌染色基礎(chǔ)就不容易出現(xiàn)難題啦！
